Relatório de Aula Prática: DIVERSIDADE MICROBIANA E DE MACRORGANISMOS EM DIFERENTES USOS DO SOLO NA FAZENDA PEDRA BRANCA E PALMITAL

Autores:

CINTHIA LUZIA TEIXEIRA SILVA
FLÁVIA MARIA DOS SANTOS
JEAN CRAMENAK DE SOUZA
LUCAS ALEXANDRE CARVALHO MIZIARA
RODOLPHO FERNANDES DOS SANTOS LIMA
RODRIGO DE FREITAS

Urutaí, 18 de junho de 2013.

1. INTRODUÇÃO

   O termo solo refere-se aqui à camada externa e agricultável da superfície terrestre (REICHARDT, et al. 2004). Nele vivem muitos organismos, incluindo insetos, minhocas e pequenos invertebrados, que são visíveis a olho nu, mas a grande maioria, em termos de peso e capacidade metabólica, são microrganismos, e a maioria é formada por bactérias (INGRAHAM, et al. 2010). Para a compreensão e o estudo da relação entre estes organismos e o solo há a microbiologia agrícola. Entre suas inúmeras ferramentas de estudo há técnicas como o uso de armadilhas “PIT FALL”, diluição em série e extração de nematóides, com intuito de analisar a diversidade de organismos em diversos ambientes.
A ciência da microbiologia iniciou-se há apenas 200 anos. Com os trabalhos de Pasteur, houve uma explosão de descobertas na microbiologia. O período de 1857 a 1914 foi propriamente chamado de Idade de Ouro da Microbiologia. Durante esse período, avanços rápidos, liderados principalmente por Pasteur e Robert Koch, levaram ao estabelecimento da microbiologia como uma ciência (TORTORA, et al. 2012).

   Quase ninguém se dá conta de que bilhões de animaizinhos populam cada metro quadrado do solo. Em parte são tão pequenos que somente podem ser vistos ao microscópio (microfauna). Em parte são visíveis a olho nu, mas ainda de tamanho tão reduzido que somente podem ser vistos com observação muito atenta (mesofauna). E em parte, são de tamanho maior, como as minhocas, centopéias e inúmeros insetos (macrofauna), de modo que já são conhecidos por todos (PRIMAVESI, 1990).
Os organismos desempenham papel importante na gênese do habitat onde vivem. Em ecossistemas em climax, a biota e o solo encontram-se em equilíbrio dinâmico, para garantir sua sustentabilidade e a biodiversidade, esse equilíbrio, porém, pode ser facilmente perturbado pelo homem ou mesmo por fenômenos naturais (SIQUEIRA, et al.1994). Essa interação entre organismos e o solo pode trazer grandes benefícios, como a ciclagem de elementos do solo controle de pragas, a biorremediação (utilização de micróbios para limpar poluentes) e biofertilizantes. Também há casos em que muitos micro-organismos do solo vivem com outros organismos. Algumas dessas relações são mutualísticas (beneficiando ambos os parceiros), e a maioria deles está nas
plantas. Duas importantes simbioses mutualísticas entre micro-organismos e plantas são as micorriza e a rizosfera (INGRAHAM, et al. 2010).

   A diversificação de espécies favorece a cobertura eficiente do solo, a exploração de volume do solo e reduz o “estreitamento genético”, contribuindo para maior diversidade e atividade de microrganismos. (SIQUEIRA, et al. 1994). No entanto, segundo Allen (1992, apud SIQUEIRA, et al. 1994) estresses naturais ou causados pelo homem em processos edáficos ou fisiológicos podem causar mudanças na composição de espécies microbianas, na sucessão de espécies simbiontes e nos atributos morfológicos e fisiológicos das associações simbióticas. A lavração, a queimada, a exposição do solo ao sol e o uso de adubos amoniacais fazem com que a maioria da mesofauna desapareça (PRIMAVESI, et al. 1990).
   Nos ambientes naturais os microrganismos se encontram, quase sempre, sob forma de populações mistas (VERMELHO, et al. 2011). Portanto, para estudarmos a diversidade desses microrganismos em diferentes ambientes, primeiramente é preciso coletá-los. São inúmeras as técnicas de coleta e extração, entre elas as armadilhas “PIT FALL” que consiste em algum equipamento (geralmente garrafas pet) que capturam principalmente organismos que habitam o solo. Também a extração por Flotação Centrífuga em solução de sacarose que é utilizada na captura de nematóides. E por fim, há também o método de diluição em série que consiste no isolamento e na contagem de microrganismos.
Enfim, os seres vivos no solo fazem parte dele, modificando-o e influenciando-se mutuamente. O solo é formado através de sua vida, e a vida é típica às características específicas do solo (PRIMAVESI, 1990). Além disso, esses organismos do solo nos fornece uma enorme lista de importâncias, como a ciclagem, biofertilização, biorremediação, engenharia genética, na formação do solo e outros. Portanto, é de grande importância estudar a interação solo-organismo e analisar sua biodiversidade.

   Este Trabalho tem como objetivo avaliar a densidade microbiana dos diferentes tipos solo, por meio do método de diluição em série. Bem como o uso de armadilhas "PIT FALL" para estudo e análise (por meios estatísticos) da diversidade de organismos nos diferentes usos do solo.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

   O experimento foi desenvolvido no dia 26 de março de 2013 na Fazenda Pedra Branca e Fazenda Palmital pertencentes à área do Instituto Federal Goiano Campus Urutaí. A prática consiste em fazer uma análise da biodiversidade das comunidades presente no local, a partir desta, foi realizada uma sequência de atividades para determinar a diversidade microbiana e de macrorganismos nas áreas. A prática foi realizada em cinco áreas diferentes onde a equipe 1 ficou com a área de pastagem da fazenda Pedra Branca, a equipe 2 com a área de Floresta, a equipe 3 com a pastagem da Fazenda Palmital e por fim, a equipe 4 com a área de cultura (Pivô).

   Para a realização da prática primeiramente foi confeccionado a armadilha “PIT FALL” (Fig. 1). As armadilhas desse tipo consistem, em geral, de um recipiente plástico enterrado ao nível do solo com líquido para matar e conservar os animais capturados (AQUINO, 2006). Cada equipe utilizou em suas respectivas áreas 5 garrafas pet de 600 mL sem o fundo, 5 estacas, 10 espetos de madeira, 5 bandejas de isopor, 5 sacos plástico, e solução preservante composta por álcool, água e detergente. Foram escolhidos 5 pontos aleatórios onde se retirou o solo com o auxilio de um enxadão e nestes mesmos locais foram colhidas e colocadas em um saco plástico amostras do solo. Então, colocou-se uma garrafa pet contendo solução preservante a modo que os organismos caiam dentro dela. Após isso, fincou-se a estaca para marcar a numeração da armadilha, e com auxílio de 2 espetos, uma bandeja de isopor foi posta como cobertura para evitar a entrada de água da chuva.

Figura 1. Esquema ilustrativo da instalação das armadilhas denominadas de "Pit fall".

   No dia posterior, 27 de março de 2013 no laboratório de microbiologia foi realizada a prática de diluição em série:

   Primeiramente todas as 5 amostras de solo foram misturadas em um balde, e logo pesou-se na balança de precisão 1 g da amostra do solo. Foram etiquetados 5 tubos de ensaio com as diluições de 10-1 até 10-5 todos contendo 9 mL de solução salina esterilizada. Assim a 1 g de solo foi colocada no tubo de diluição 10-1, onde este foi agitado por 1 minuto no agitador. Depois, com o auxílio de uma pipeta graduada foi transferido 1 mL da solução para o tubo de ensaio 10-2 (Fig. 2), onde este também foi agitado por 1 minuto. O mesmo procedimento foi realizado até a diluição 10-5. Terminado o procedimento as diluições 10-1 e 10-2 foram descartadas.

Figura 2. Esquema que representa e ilustra a técnica de diluição em série para demonstrar a densidade microbiana nas amostras.

   Na câmara de fluxo laminar com o auxilio da micropipeta foi adicionado100 μL da diluição 10-3 no meio BDA onde a solução foi espalhada com movimentos circulares utilizando a alça de Drigalski já flambada (Fig. 2). Então, foram etiquetadas 6 placas de Petri, sendo utilizadas 2 placas de cada meio por diluição (10-3, 10-4 e 10-5). As placas foram vedadas e levadas à 35º C na estufa de crescimento por 48 horas.

   Então, passado 48 horas, foi contado as unidades de colônias formadoras (ufc), onde considera-se o número de colônias observadas visualmente. Assim, foi realizado o
cálculo da densidade microbiana em que se utiliza a regra de três, em que o número de colônias contadas refere-se a 100 μL, onde este é o mesmo que 1 mL, portanto, o número de colônias formadoras é multiplicado por 10 e depois novamente multiplicado pelo fator de diluição, encontrando a unidade de colônias formadoras por mL, como mostra o seguinte exemplo:

Figura 3. Método de calculo do número de unidades formadoras de colônias por mL.



   Posteriormente, os valores encontrados de ufc passaram pela análise estatística no programa SAS.
Neste mesmo dia foi realizada também a extração de nematóides do solo pelo método de Flotação centrífuga em solução de sacarose:

   Primeiramente foram pesados 110 g do solo coletado, depois a amostra foi colocada em uma bacia onde foi adicionadas 10 medidas de água em uma proveta de 1000 mL, totalizando 10 litros. Assim, a solução foi agitada e depois peneirada em uma armação de 3 peneiras acopladas. O material retido na última peneira foi recolhido com o auxílio de uma pisseta com água destilada e colocado em uma placa de Petri. Assim com o auxílio da lupa foi visualizado se havia nematóides na suspensão. Então a suspensão foi transferida para dois tubos de ensaio contendo água destilada. As amostras foram centrifugadas na velocidade 2 por 3 minutos. Com o auxilio de uma pipeta graduada o sobrenadante foi retirado dos tubos e descartado. Ao precipitado foi adicionado sacarose, logo as amostras foram levadas novamente a centrífuga por 3 minutos. Assim, o sobrenadante foi vertido na peneira e foi lavado cuidadosamente com água destilada, e a amostra foi recolhida em um pequeno frasco de vidro que foi etiquetado e levado à geladeira.

   Ao passar 7 dias após a instalação das armadilhas “PIT FALL”, no dia 02 de abril de 2013 as equipes voltaram aos locais e recolheram as amostras que foram levadas ao laboratório de microbiologia do Instituto Federal Goiano Campus Urutaí. Todas as garrafas pet contendo organismos capturados foram peneiradas e passadas em água corrente separadamente, assim com o auxilio de uma pinça os indivíduos foram contados conforme sua espécie, todos os dados foram anotados e os organismos de cada amostra foram colocados em pequenos frascos de vidro contendo álcool 50% que foram etiquetados e guardados.
Com os dados anotados foi feita uma análise estatística no software SPADE, onde obteve-se os índices de Riqueza de Espécies, índice de Shannon, Simpson e Fisher. Os valores encontrados de cada equipe foram organizados em tabela e levados novamente a outra análise estatística no software SAS. Obtendo então, a análise de significância (ANOVA) e o teste de Tukey.



3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

   Nas armadilhas “PIT FALL”, foram capturados 12 ordens de insetos (Tabela 1), totalizando 1614 indivíduos, em sua maioria de importância agrícola. Entre os insetos capturados a maioria foi formigas (ordem Hymenoptera) totalizando 995 indivíduos.

   Pode-se notar que a maioria dos indivíduos capturados pelas armadilhas é de importância agrícola, principalmente os organismos que quando estão em grande número causam danos à agricultura.   Muitos dos organismos encontrados foram besouros de armazenamento-caruncho que afetam os grãos, alguns percevejos, grilos, gafanhotos e muitas formigas que atingem principalmente as folhas da vegetação. Mas, também houve a incidência de indivíduos benéficos à vegetação como polinizadores representados pelas abelhas, aranhas que são predadoras de outros insetos, porém estes foram encontrados em menor número.

Tabela 1. Número de individuos quantificados em cada ordem pelos grupos (diferentes usos de solo) coletados nas Fazendas Palmital e Pedra Branca, Urutaí, GO, 2013.

 

    Observando os dados da tabela 1, pode-se notar que houve a ocorrência de besouros, principalmente de armazenamentos (Coleóptera), cigarrinhas e percevejos da ordem hemíptera, vespas e muitas formigas (Hymenoptera), moscas (díptera), grilos e gafanhotos de ordem Orthoptera, mariposas (Lepidóptera), pererecas (Anura). Também foram encontradas baratas da ordem Blattaria, aranhas, cupins e piolho de cobra (ordem Spirostreptida e subfilo miriápode).

   A área de pastagem 1 (Fazenda Pedra Branca) apresentou os menores índices, isso ocorreu por ser uma área com pouca vegetação, e matéria orgânica. Além disso, uma das armadilhas desta área foi danificada pelo fato do local estar ocupado por um rebanho bovino, assim diminuindo as chances de ter capturado mais indivíduos.

   Era esperado que a área de Floresta apresentasse maior número de indivíduos, por causa da diversidade de vegetais, maior área rizosférica e maior quantidade de matéria orgânica facilitando a sobrevivência dos organismos. Porém, foi a área de Pastagem 2 (Fazenda Palmital) que apresentou um maior número de indivíduos em um total de 954. Mas, nesta área houve a predominância de um tipo de indivíduos que foi as formigas e vespas (ordem Hymenoptera), devido à proximidade com os formigueiros que havia na área.

   Nos meios de cultura que foram preparados, no geral apresentaram crescimento microbiológico, com exceção de um dos meio contendo solução 10-5 da equipe 3- Pastagem 2 (Fazenda Palmital). E comparando o número de colônias entre as equipes, a área de Pastagem 2 foi a que apresentou uma média bem menor.

Tabela 2. Média do número de unidades formadoras de colônias por mL de solução do solo (ufc/mL) em relação às diluições.

   Era esperado que a área de floresta apresentasse maior número de vida microbiana, por causa da grande área rizosférica e grande quantidade de matéria orgânica fornecida. Porém, a área de culturas apresentou maior número (Fig.3). Uma possível explicação é que o solo provavelmente forneça uma grande quantidade de matéria orgânica e uma rica rizosfera, pois a área era de cultivo de milho e feijão e apresentava palhada sobre o solo. Também há a possibilidade de ter ocorrido um erro experimental na realização da diluição em série na homogeneização do solo com a solução, ademais, talvez haja um fator de desequilíbrio onde tal espécie possa estar predominando no momento, por falta de competição ou agentes que controlam a população do local. Segundo Siqueira et. al. (1994), as alterações nas condições do solo, provocadas pelo seu uso e manejo, promovem modificações qualitativas e quantitativas, levando a comunidade a novo equilíbrio. Portanto, em vez da população de indivíduos do local diminuísse desta vez ocorreu o aumento devido o uso e o tipo de manejo do solo.

Figura 3. Médias dos números de unidades formadoras de colônias encontrados nas amostragens realizadas nos diferentes usos do solo.

Figura 4. Médias dos calores de ufc nos diferentes usos do solo (médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste Tukey P~0,05).

   Pelo teste de Tukey (Fig. 4) percebeu-se que as áreas (tratamentos) de pastagem 1 e pastagem 2 apresentaram estatisticamente médias de ufc que não se diferem entre estas, assim sendo classificadas como tratamentos “b”. Enquanto a área de cultura se diferiu das demais sendo denominada como tratamento “a”. Já a área de floresta foi classificada “ab”, ou seja, ela possui média próxima tanto a área de cultura quanto as demais.

   Já em relação à contagem de organismos coletados pela armadilha “PIT FALL”, estatisticamente, pelo teste F (ANOVA), hipótese da nulidade (H0) foi rejeitada tanto a 1% quando a 5 % (0,05), sendo o valor F calculado maior que o valor F tabelado (Tabela 3), ou seja, as médias se diferem entre elas, portanto os tratamentos são diferentes.

Tabela 3. Valores F dos parâmetros calculados a partir dos dados de abundância.

   Assim, rejeitando H0 prevalece H1, ou seja, permanece uma hipótese alternativa. A provável explicação sobre a diferença entre os tratamentos é que nos tratamentos perdidos houve uma reposição de dados aleatoriamente com os dados já existentes. Também há a questão das áreas analisadas, em que os locais se diferem. Entre a floresta, pastagem 1, pastagem 2 e culturas é de se esperar que a floresta apresente dados bem superiores aos outros, pois é uma área que possui uma rica diversidade em vegetação, fornecendo condições para a sobrevivência dos indivíduos. Para isso temos os testes de Tukey para os fatores de variação e seus respectivos gráficos:

 Figura 5. Médias dos valores do índice de Tukey para riqueza de espécies  (médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste Tukey P~0,05).

   Sobre o teste de Riqueza de Espécies (Fig. 5), espécies raras e diversificadas tem maior peso, portanto, a área de Floresta apresentou maior índice de 25.3, enquanto a pastagem 2 (fazenda Palmital), culturas e pastagem 1 (Pedra Branca) apresentaram valores 22.5; 10.2 e 4.1 respectivamente. Floresta e Pastagem 2 foram classificados como tratamentos “a”, apresentando os maiores índices por terem um maior número e diversidade de organismos capturados. Sendo assim, estas duas áreas são estatisticamente classificadas como iguais e diferentes das demais.

Figura 6. Médias dos valores de índice de Shannon (médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste Tukey P~0,05).

   No índice de Shannon (Fig. 6) é avaliada a heterogeneidade, onde se leva em consideração a riqueza, a quantidade de espécies diferentes. Por sua vez a floresta, pastagem 2, cultura e pastagem 1 apresentaram os valores 1.1; 1.6; 1.5 e 0.6 respectivamente. Nesse caso, o tratamento que se diferenciou dos demais foi a pastagem 1, apresentando menor índice, pois seus tratamentos apresentou menor número de diversidade, sendo uma área mais homogênia em relação as outras.

Figura 7. Médias dos valores de índice de Simpson (médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste Tukey P~0,05).

   Este teste de Simpson (Fig. 7) também leva em consideração a riqueza, mas propriamente analisa a dominância, onde há probabilidade de dois indivíduos serem sorteados de uma mesma comunidade pertencer à mesma espécie (MARTINI, et al. 2010). Neste índice, a pastagem 1 obteve maior índice, pois possui um número menor de indivíduos, sendo as chances de estes organismos serem da mesma espécie, portanto, está área se diferenciou das outras com média de 0.7, enquanto pastagem 2, floresta e cultura apresenta médias 0.35; 0.33 e 0.33 respectivamente.

Figura 8. Médias dos valores de índice de Fisher (médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste Tukey P~0,05).

   Já no teste de Fisher (Fig. 8) é analisada a relação do número de espécies representadas por apenas 1 indivíduo na comunidade. Assim, a área de floresta apresentou maior média de 8.1 diferindo dos demais tratamentos que apresentaram médias 3.8 para a pastagem 2, 2.4 para a área de cultura e 1.2 para a pastagem 1. Apesar de que as duas pastagens e a cultura tenham apresentadas médias numericamente diferentes pelo teste de Tukey elas não diferem entre si. Isso, mais uma vez pode ser explicado pela grande diversidade que a área de floresta apresenta, pois ela apresenta uma vegetação mais diversificada, fornecendo maior quantidade de material orgânico e consequentemente um maior número de organismos interagindo no ambiente.

4. CONCLUSÕES

   Com a realização das armadilhas “PIT FALL” foi possível capturar e analisar a diversidade microbiana e de macrorganismos das diferentes áreas nas fazendas Palmital e Pedra Branca no município de Urutai- Goiás.

   Era esperado que a área de Floresta apresentasse maior número de macrorganismos, pelo fato de fornecer maior diversidade na flora, maior área rizosférica e maior quantidade de matéria orgânica, facilitando a sobrevivência dos organismos. Porém, a área de Pastagem 2 (Fazenda Palmital) apresentou um maior número, mas, porque houve a predominância de formigas devido à proximidade com os formigueiros que havia na área. Tal quantidade de formigas na área pode ter ocorrido pela quantidade de alimento disponível na área, que apresentava grande quantidade de braquiária e outras plantas, além disso, possivelmente não há uma taxa de predação considerável, favorecendo a sobrevivência de tantas formigas.

   Em relação ao número de unidades formadoras de colônias (ufc), mais uma vez era esperado que a área de floresta apresentasse maior número de vida microbiana, mas, a área de culturas apresentou maior número o que foi possível por causa da grande quantidade de matéria orgânica originada do cultivo de milho e feijão e a palhada sobre o solo. Porém, com as análises estatísticas a área de floresta se destacou, pois a maioria dos testes analisava a diversidade de espécies.

   Em grande parte os resultados obtidos podem ser relacionados à disponibilidade de alimento nos solos analisados, quanto maior a quantidade de matéria orgânica e vegetação presentes, maior é a atividade microbiana e dos macrorganismos. É um ciclo onde o meio-solo e os organismos se beneficiam em que o solo fornece condições para a sobrevivência e os seres que nele vivem transformam os materiais, reciclando e “devolvendo-os”. Além disso, outros fatores também podem influenciar o tipo e a quantidade de organismos vivos no solo, tais como fatores antropogênicos, clima e temperatura.

   Enfim, o solo não é um conjunto residencial onde os seres vivos coexistem sem se conhecerem uns aos outros. Não existem espécies isoladas, habilmente classificadas, existe sim, uma sociedade intimamente inter-relacionada. O meio ambiente são todos os fatores físicos, químicos e biológicos de um lugar. Portanto, os seres vivos que existem num determinado lugar são sempre uma comunidade determinada pelas condições reinantes e nunca são espécimes isolados, que por acaso, ali existem, segundo Castri (1968, apud PRIMAVESI, 1990).

5. LITERATURA CITADA

AQUINO, A. M.; MENEZES, E. L. A.; QUEIROZ, J. M. Recomendações para coleta de artrópodes terrestres por armadilhas de queda (“Pitfall- Traps”). Disponível em: acessado em 02 de maio de 2013.
INGRAHAM, J. L.; INGRAHAM, C. A. Introdução à microbiologia. 3ª. Ed. Editora CENGAGE Learning. São Paulo-SP. 2010.
MARTINI, A. M. Z.; PRADO, P. J. K. L. Índices de diversidade de espécies. Disponível em: acessado em 02 de maio de 2013.
PRIMAVESI, A. Manejo Ecológico do Solo. 9ª. Ed. Editora Nobel. São Paulo-SP. 1990.
REICHARDT, K. ; TIMM, L. C. Solo, Planta e Atmosfera – Conceitos, Processos e Aplicações. 1ª. Ed. Editora Manole Ltda. Barueri-SP. 2004.
SIQUEIRA, J. O. ; MOREIRA, F. M. S.; GRISI, B. M.; HUNGRIA, M.; ARAUJO R. S. Microrganismos e processos biológicos do solo: Perspectiva ambiental. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Centro Nacional de Pesquisa de Arroz e Feijão, Centro Nacional de Pesquisa de Soja. EMBRAPA, Brasília, 1994.
TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 10ª. Ed. Editora Artmed. Porto Alegre-RS. 2012.
VERMELHO, A. B.; PEREIRA, A. F.; COELHO R. R. R.; PADRÓN, T. S. Práticas de Microbiologia. Volume Único, Editora Guanabara Koogan. Rio de Janeiro-RJ. 2011.