LAMP na identificação de fungos fitopatogênicos: princípios, aplicações e perspectivas para o diagnóstico rápido de doenças de plantas

 

Introdução

O diagnóstico rápido e confiável de fungos fitopatogênicos é uma etapa fundamental para a tomada de decisão em programas de manejo de doenças de plantas. Métodos tradicionais baseados em sintomas, isolamento, características culturais e identificação morfológica continuam sendo importantes, mas podem demandar tempo e, em determinados grupos, apresentar limitações para discriminar espécies morfologicamente semelhantes. Nesse contexto, métodos moleculares baseados na amplificação de ácidos nucleicos passaram a ocupar posição estratégica no diagnóstico fitossanitário (NÉMETH; KOVÁCS, 2025; YANG et al., 2025). (PubMed Central (PMC))

Entre as tecnologias desenvolvidas para acelerar a detecção de patógenos destaca-se a LAMP — Loop-mediated Isothermal Amplification, ou amplificação isotérmica mediada por alça. A técnica foi descrita originalmente por Notomi et al. (2000) como um método de amplificação de DNA realizado sob temperatura constante, utilizando uma DNA polimerase com atividade de deslocamento de fita e um conjunto de primers capazes de reconhecer múltiplas regiões do DNA-alvo (NOTOMI et al., 2000). (PubMed Central (PMC))

Nas duas últimas décadas, a LAMP foi adaptada para a detecção de diversos grupos de fitopatógenos. Uma revisão publicada em 2025 identificou aplicações da técnica para fungos e oomicetos fitopatogênicos envolvendo detecção, identificação, monitoramento, substituição de métodos baseados em cultivo e até detecção de determinadas alterações genéticas (NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (Frontiers)

Para a Fitopatologia, a principal característica da LAMP é a possibilidade de realizar amplificação de DNA sem a necessidade de um termociclador convencional. Isso abre perspectivas para diagnóstico descentralizado, análises em campo e sistemas de detecção próximos ao local de produção, desde que o ensaio tenha sido adequadamente validado quanto à especificidade, sensibilidade e robustez (YANG et al., 2025; NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (APS Journals)

O que é a técnica LAMP?

A LAMP é uma técnica de amplificação isotérmica de ácidos nucleicos. Diferentemente da PCR convencional, que depende de ciclos sucessivos de desnaturação, anelamento e extensão em diferentes temperaturas, a LAMP realiza a amplificação em uma faixa de temperatura aproximadamente constante, utilizando uma DNA polimerase com atividade de deslocamento de fita (NOTOMI et al., 2000). (PubMed)

O sistema originalmente descrito utiliza quatro primers principais — F3, B3, FIP e BIP — que reconhecem seis regiões distintas do DNA-alvo. Essa arquitetura molecular contribui para a especificidade da reação, pois a amplificação depende do reconhecimento de múltiplas sequências no alvo (NOTOMI et al., 2000). (DOI)

Posteriormente, foram incorporados primers adicionais, denominados loop primers, que podem acelerar a amplificação ao fornecerem regiões adicionais para iniciação da síntese. Assim, ensaios LAMP modernos podem utilizar seis primers, dependendo do desenho experimental e da finalidade do teste (NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (Frontiers)

Durante a reação, são formadas estruturas de DNA em formato de alça, que servem como substratos para ciclos sucessivos de síntese e deslocamento de fita. O processo produz grandes quantidades de DNA amplificado e estruturas moleculares características da LAMP, permitindo a detecção do produto por diferentes estratégias (NOTOMI et al., 2000; NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (DOI)

Por que a LAMP é interessante para a Fitopatologia?

A principal vantagem da LAMP para o diagnóstico fitopatológico está na combinação entre amplificação isotérmica, rapidez, sensibilidade, especificidade e menor dependência de equipamentos sofisticados. Essa combinação permite imaginar sistemas de diagnóstico mais próximos do campo e de laboratórios com infraestrutura molecular limitada (NÉMETH; KOVÁCS, 2025; YANG et al., 2025). (Frontiers)

A técnica também pode apresentar elevada sensibilidade. Em estudos específicos com fungos e oomicetos fitopatogênicos, ensaios LAMP apresentaram limites de detecção muito baixos, embora esses valores sejam dependentes do organismo, do gene-alvo, do desenho dos primers, da qualidade da amostra e do método de extração de DNA (NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (PubMed Central (PMC))

Outro aspecto importante é a possibilidade de visualização do resultado sem necessariamente utilizar um equipamento sofisticado de PCR em tempo real. Diferentes sistemas podem ser empregados para revelar a amplificação, incluindo corantes, indicadores de mudança de cor, fluorescência, turbidez e eletroforese em gel (YANG et al., 2025; NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (APS Journals)

Essa característica torna a LAMP particularmente interessante para situações nas quais a pergunta diagnóstica precisa ser respondida rapidamente, como triagem de material vegetal, monitoramento de áreas de produção, detecção precoce de patógenos ou análises fitossanitárias próximas ao local de coleta (NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (PubMed Central (PMC))

LAMP não é simplesmente uma "PCR sem termociclador"

Embora seja comum apresentar a LAMP como uma alternativa simples à PCR, mecanisticamente as duas técnicas são diferentes. A PCR utiliza ciclos térmicos para separar as fitas de DNA e permitir a extensão dos primers, enquanto a LAMP utiliza uma polimerase com atividade de deslocamento de fita e uma arquitetura de primers que permite a amplificação contínua em temperatura aproximadamente constante (NOTOMI et al., 2000). (DOI)

Essa diferença tem consequências práticas. A LAMP pode dispensar o termociclador convencional, mas isso não significa que qualquer reação possa ser realizada simplesmente aquecendo DNA em uma temperatura fixa. O desempenho depende do desenho dos primers, da escolha da região-alvo, da composição da reação, da atividade enzimática, da temperatura e da qualidade do material analisado (NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (Frontiers)

A escolha do alvo molecular é uma etapa crítica

A identificação molecular de um fungo depende inicialmente da escolha de uma região do genoma que apresente características adequadas para discriminar o organismo de interesse. O alvo deve possuir regiões suficientemente conservadas para permitir o desenho dos primers, mas também diferenças suficientes para distinguir o patógeno de organismos próximos (NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (Frontiers)

Em fungos, regiões do DNA ribossomal, genes codificadores de proteínas e marcadores específicos de determinadas espécies ou grupos podem ser utilizados, dependendo do objetivo do diagnóstico. A região ITS é amplamente utilizada na identificação molecular de fungos, mas não apresenta resolução suficiente para todos os grupos; por isso, outros marcadores podem ser necessários em espécies filogeneticamente próximas (SCHOCH et al., 2012; NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (PubMed Central (PMC))

A LAMP acrescenta uma exigência importante: o alvo precisa apresentar uma arquitetura adequada para acomodar múltiplos sítios de ligação dos primers. Por isso, uma região adequada para PCR convencional não é necessariamente adequada para o desenvolvimento de um ensaio LAMP específico (NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (Frontiers)

O desenho dos primers é o coração da LAMP

O desenho de primers é uma das etapas mais críticas para o desenvolvimento de um ensaio LAMP. Os primers internos e externos devem reconhecer diferentes regiões do alvo e apresentar características de sequência compatíveis com a amplificação isotérmica (NOTOMI et al., 2000; NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (DOI)

A utilização de múltiplos primers aumenta a especificidade potencial da reação, mas também torna o desenho experimental mais complexo do que em uma PCR convencional. Pequenas alterações na escolha das regiões-alvo podem modificar significativamente a eficiência da amplificação e a possibilidade de ocorrência de produtos inespecíficos (NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (Frontiers)

Por essa razão, o desenvolvimento de um ensaio LAMP deve envolver análise in silico das sequências disponíveis, avaliação da variabilidade genética do patógeno e comparação com organismos filogeneticamente próximos. Esse procedimento é particularmente importante para gêneros que apresentam complexos de espécies, como Fusarium, Colletotrichum e Phytophthora (NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (PubMed Central (PMC))

Como detectar o produto da LAMP?

Uma das características mais interessantes da LAMP é a variedade de formas disponíveis para visualizar o resultado. Dependendo do desenho do ensaio, a amplificação pode ser acompanhada por fluorescência, turbidez, eletroforese ou indicadores colorimétricos (YANG et al., 2025). (APS Journals)

Indicadores como hydroxynaphthol blue (HNB) foram utilizados em ensaios destinados à detecção de fungos fitopatogênicos. A mudança de coloração permite distinguir visualmente reações positivas e negativas, eliminando, em determinadas aplicações, a necessidade de eletroforese para uma primeira interpretação do resultado (GHOSH et al., 2015). (PubMed Central (PMC))

Outro caminho consiste na utilização de corantes fluorescentes ou sistemas de detecção em tempo real. Essa estratégia permite acompanhar a amplificação durante a reação e pode fornecer informações adicionais sobre a cinética do ensaio, embora normalmente exija algum equipamento específico (NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (Frontiers)

Exemplo 1: Fusarium oxysporum f. sp. ciceris

Um exemplo clássico da aplicação da LAMP em Fitopatologia foi desenvolvido para Fusarium oxysporum f. sp. ciceris, agente associado à murcha de Fusarium do grão-de-bico. O problema diagnóstico nesse patossistema é agravado pelo fato de outros patógenos habitantes do solo poderem produzir sintomas semelhantes, dificultando a identificação exclusivamente no campo (GHOSH et al., 2015). (PubMed Central (PMC))

O ensaio desenvolvido por Ghosh et al. (2015) utilizou como alvo uma região do gene EF-1α e empregou HNB para visualização. Nas condições avaliadas pelos autores, a reação foi otimizada a 63 °C durante 60 minutos, e o limite de detecção relatado foi de 10 fg de DNA genômico por reação, enquanto a PCR convencional apresentou limite de 100 pg nas condições comparadas (GHOSH et al., 2015). (PubMed Central (PMC))

Esse estudo é particularmente interessante porque demonstra a possibilidade de combinar um marcador molecular com uma detecção visual relativamente simples. Entretanto, os valores de sensibilidade apresentados em um estudo específico não devem ser generalizados para todos os ensaios LAMP, pois o desempenho depende do alvo, dos primers, da matriz e das condições experimentais (GHOSH et al., 2015; NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (PubMed Central (PMC))

Exemplo 2: Botrytis cinerea

A LAMP também foi desenvolvida para Botrytis cinerea, agente causal do mofo-cinzento em diversas espécies vegetais. Duan et al. (2014) desenvolveram um ensaio direcionado à sequência Bcos5, utilizando HNB para visualização do resultado (DUAN et al., 2014). (PLOS)

Nas condições descritas pelos autores, a reação apresentou temperatura ótima de 63 °C e duração de 45 minutos. Amostras contendo DNA de B. cinerea produziram mudança característica de coloração, enquanto controles sem DNA do patógeno e amostras contendo DNA de outros fungos fitopatogênicos não apresentaram o mesmo resultado (DUAN et al., 2014). (PLOS)

Esse exemplo demonstra uma das aplicações mais interessantes da LAMP: transformar uma questão molecular — "o DNA do patógeno está presente?" — em uma resposta visual que pode ser obtida em tempo relativamente curto (DUAN et al., 2014; NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (PLOS)

Exemplo 3: Phytophthora infestans

Embora Phytophthora infestans seja um oomiceto e não um fungo verdadeiro, ele constitui um excelente exemplo de aplicação da LAMP em Fitopatologia. O agente causal da requeima da batata e do tomate foi alvo de diferentes ensaios LAMP destinados à detecção rápida em tecidos vegetais (KHAN et al., 2017; SI AMMOUR et al., 2017). (Frontiers)

Khan et al. (2017) desenvolveram uma LAMP direcionada ao gene Ypt1 de P. infestans. No estudo, a técnica apresentou maior sensibilidade que os métodos de PCR comparados e não apresentou reação cruzada com as espécies e organismos avaliados pelos autores (KHAN et al., 2017). (Frontiers)

Outro estudo desenvolveu ensaios isotérmicos em tempo real direcionados à região ITS2 do DNA ribossomal de P. infestans e avaliou sua utilização diretamente em folhas de batata. Os autores relataram detecção do patógeno em folhas sem sintomas até 24 horas após a inoculação experimental, demonstrando o potencial da técnica para diagnóstico precoce (SI AMMOUR et al., 2017). (PubMed)

É importante, entretanto, observar uma limitação relevante desse último estudo: os ensaios apresentaram reação também com algumas espécies de Phytophthora filogeneticamente próximas. Portanto, "detectar P. infestans" não é automaticamente equivalente a "distinguir P. infestans de todas as espécies próximas" — a especificidade deve sempre ser demonstrada experimentalmente contra o painel adequado de organismos relacionados (SI AMMOUR et al., 2017). (PubMed)

LAMP para diagnóstico antes do aparecimento dos sintomas

Uma das aplicações mais promissoras da técnica é a detecção do patógeno em fases iniciais da infecção. Em diversas doenças, os sintomas visíveis surgem apenas depois que o patógeno já se estabeleceu e se multiplicou no hospedeiro, criando uma janela na qual o diagnóstico molecular pode ser realizado antes que a doença seja facilmente reconhecida visualmente (NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (PubMed Central (PMC))

Revisões recentes relatam aplicações de LAMP para detecção precoce de diferentes fungos e oomicetos, incluindo espécies de Puccinia, Sporisorium, Fusarium e Phytophthora. Em determinados estudos, o patógeno pôde ser detectado antes da manifestação evidente dos sintomas (NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (PubMed Central (PMC))

Essa característica pode ser particularmente relevante para doenças de difícil manejo após o estabelecimento da epidemia. A detecção precoce pode fornecer informação para tomada de decisão, monitoramento de focos e avaliação da presença do patógeno em material aparentemente assintomático, embora a utilidade prática dependa da validação do teste e do contexto epidemiológico (NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (Frontiers)

LAMP não substitui automaticamente o isolamento e a identificação clássica

Apesar de suas vantagens, a LAMP não deve ser interpretada como substituta universal dos métodos convencionais. A detecção de DNA demonstra a presença do material genético correspondente ao alvo, mas não necessariamente demonstra que o organismo esteja viável ou que seja o agente causal dos sintomas observados (NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (Frontiers)

Em determinadas situações, o isolamento continua sendo necessário para obter uma cultura, realizar caracterização fenotípica, estudar patogenicidade, obter material para sequenciamento ou manter uma coleção de referência. Da mesma maneira, a demonstração de causalidade pode exigir experimentos adicionais, especialmente quando o patógeno é detectado em tecidos assintomáticos ou quando existem organismos relacionados que podem colonizar o mesmo hospedeiro (NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (PubMed Central (PMC))

Assim, a LAMP deve ser entendida como uma ferramenta molecular de diagnóstico, e não como uma metodologia que, isoladamente, resolve todas as etapas da diagnose fitopatológica. Seu maior valor está na integração com informações epidemiológicas, sintomatológicas, morfológicas e, quando necessário, métodos moleculares complementares (YANG et al., 2025; NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (APS Journals)

Especificidade: o ponto crítico

A elevada especificidade potencial da LAMP é uma de suas principais vantagens, mas também representa um desafio. Como a reação utiliza múltiplos sítios de reconhecimento, o desenho inadequado dos primers pode resultar em amplificação inespecífica ou dificultar a interpretação do ensaio (NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (Frontiers)

A validação da especificidade deve incluir não apenas isolados do organismo-alvo, mas também organismos filogeneticamente próximos, patógenos que ocorrem no mesmo hospedeiro e, quando relevante, microrganismos que podem estar presentes na mesma matriz vegetal ou no solo (NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (PubMed Central (PMC))

Esse cuidado é especialmente importante em gêneros como Fusarium, Colletotrichum e Phytophthora, nos quais espécies estreitamente relacionadas podem compartilhar regiões genômicas muito semelhantes. Um ensaio aparentemente específico quando testado contra poucos organismos pode apresentar reação cruzada quando ampliado para um painel taxonomicamente mais representativo (NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (Frontiers)

Sensibilidade não é sinônimo de eficiência diagnóstica

A LAMP pode apresentar elevada sensibilidade analítica, mas um limite de detecção extremamente baixo não garante, por si só, um diagnóstico superior. O desempenho diagnóstico também depende da coleta da amostra, extração do DNA, presença de inibidores, distribuição espacial do patógeno, qualidade dos controles e especificidade do alvo (YANG et al., 2025; NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (APS Journals)

Tecidos vegetais podem conter compostos capazes de interferir em reações de amplificação. Por isso, métodos de extração simplificados precisam ser validados especificamente para cada matriz vegetal e para o patógeno investigado, principalmente quando se pretende levar a LAMP para condições de campo (NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (Frontiers)

No estudo de P. infestans, por exemplo, um método de preparação rápida de extrato vegetal bruto foi desenvolvido para testes no local de coleta, e os autores verificaram que o ensaio LAMP manteve desempenho adequado na presença da matriz vegetal avaliada (SI AMMOUR et al., 2017). (PubMed)

Um fluxo de diagnóstico utilizando LAMP

Um fluxo conceitual para aplicação da LAMP em um laboratório de Fitopatologia pode começar com a coleta de tecido vegetal representativo, seguida pela preparação da amostra e extração ou liberação do DNA. O DNA obtido é então submetido ao ensaio LAMP desenvolvido especificamente para o organismo-alvo, com controles apropriados para permitir a interpretação da reação (NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (Frontiers)

A interpretação deve considerar simultaneamente o controle positivo, o controle negativo, o controle de extração e, quando necessário, controles para monitorar inibição da reação. Essa estrutura é particularmente importante porque uma reação positiva em uma amostra vegetal não deve ser interpretada isoladamente, sem verificar se o sistema analítico funcionou adequadamente (YANG et al., 2025; NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (APS Journals)

Em uma rotina diagnóstica, a LAMP pode funcionar como método de triagem rápida, enquanto amostras positivas podem ser submetidas posteriormente a métodos confirmatórios, como PCR convencional, qPCR, sequenciamento ou isolamento, dependendo da finalidade do diagnóstico (YANG et al., 2025). (APS Journals)

LAMP, PCR e qPCR: qual a diferença?

A PCR convencional continua sendo uma das principais ferramentas da diagnose molecular de fitopatógenos porque permite amplificação específica seguida de diferentes estratégias de análise. A LAMP diferencia-se principalmente pela amplificação isotérmica e pelo uso de múltiplos primers, enquanto a qPCR permite acompanhar a amplificação em tempo real e, quando adequadamente calibrada, realizar quantificação relativa ou absoluta (YANG et al., 2025). (APS Journals)

A qPCR apresenta vantagens importantes para estudos quantitativos e análises que exigem maior controle da cinética da reação, mas geralmente demanda equipamentos e reagentes mais sofisticados. A LAMP pode apresentar uma infraestrutura mais simples e, por isso, possui potencial para aplicações descentralizadas e testes próximos ao campo (NÉMETH; KOVÁCS, 2025; YANG et al., 2025). (Frontiers)

Portanto, não existe uma técnica universalmente superior. A escolha deve considerar a pergunta diagnóstica, o nível de especificidade necessário, a necessidade de quantificação, a infraestrutura disponível, o tipo de amostra e a finalidade do resultado (YANG et al., 2025). (APS Journals)

Limitações da LAMP

Apesar das vantagens, a LAMP apresenta limitações importantes. A primeira está relacionada ao desenho dos primers, que é mais complexo do que em uma PCR convencional. A segunda envolve o risco de contaminação, particularmente porque a reação pode gerar grande quantidade de produto amplificado (NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (Frontiers)

A elevada quantidade de amplicons produzida durante a reação aumenta a necessidade de organização física e operacional do laboratório. A abertura de tubos após a amplificação pode facilitar a dispersão de produtos amplificados e aumentar o risco de contaminação de reações subsequentes, podendo gerar resultados falso-positivos (NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (Frontiers)

Outro problema é a possibilidade de amplificação inespecífica. A interpretação visual por mudança de cor, embora seja extremamente conveniente, pode ser menos informativa do que sistemas que permitem caracterizar diretamente o produto amplificado. Por isso, a validação do método deve estabelecer claramente critérios de positividade e, quando necessário, utilizar métodos confirmatórios (NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (Frontiers)

O futuro: diagnóstico molecular no campo

A evolução da LAMP está ocorrendo em direção a sistemas cada vez mais portáteis. Plataformas de detecção em tempo real, dispositivos miniaturizados, sistemas microfluídicos e integração com tecnologias de análise digital estão sendo estudados para aproximar a diagnose molecular do local de produção (NÉMETH; KOVÁCS, 2025; YANG et al., 2025). (Frontiers)

Outra perspectiva é a combinação da amplificação isotérmica com tecnologias de reconhecimento molecular, incluindo sistemas baseados em CRISPR/Cas. Revisões recentes descrevem a integração de LAMP com CRISPR como uma possibilidade para aumentar a especificidade da detecção e desenvolver plataformas de diagnóstico molecular de menor infraestrutura (YANG et al., 2025; WANG et al., 2026). (APS Journals)

Para a Fitopatologia, essas tecnologias podem contribuir para uma mudança importante: sair de um modelo no qual a identificação do patógeno depende exclusivamente de laboratórios centralizados e caminhar para sistemas nos quais parte da triagem molecular possa ser realizada próxima ao campo, com posterior confirmação laboratorial quando necessário (NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (PubMed)

Considerações finais

A LAMP representa uma das principais alternativas de amplificação isotérmica aplicadas ao diagnóstico de fitopatógenos. Sua combinação de amplificação em temperatura constante, múltiplos sítios de reconhecimento, rapidez e possibilidade de detecção visual torna a técnica particularmente interessante para a identificação de fungos e oomicetos fitopatogênicos (NOTOMI et al., 2000; NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (DOI)

Os exemplos de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris, Botrytis cinerea e Phytophthora infestans demonstram que a tecnologia já foi adaptada para diferentes patossistemas e pode apresentar elevada sensibilidade e especificidade quando adequadamente desenvolvida e validada (GHOSH et al., 2015; DUAN et al., 2014; KHAN et al., 2017; SI AMMOUR et al., 2017). (PubMed Central (PMC))

Entretanto, a LAMP não deve ser considerada uma substituta automática da PCR, da qPCR, do isolamento ou da identificação morfológica. A técnica é mais bem compreendida como uma ferramenta que pode integrar uma estratégia diagnóstica multimodal, particularmente útil quando rapidez, simplicidade e possibilidade de utilização fora de laboratórios altamente equipados são prioridades (YANG et al., 2025; NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (APS Journals)

O desenvolvimento de um bom ensaio LAMP depende, sobretudo, da escolha correta do alvo molecular, do desenho criterioso dos primers, da avaliação de especificidade contra organismos próximos, da determinação do limite de detecção, da validação em diferentes matrizes vegetais e da utilização de controles adequados. Portanto, a qualidade de um diagnóstico LAMP não está apenas na velocidade da amplificação, mas na robustez do sistema diagnóstico como um todo (NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (Frontiers)

Para a Fitopatologia aplicada, a perspectiva mais interessante talvez esteja na integração entre LAMP, extração simplificada de DNA, dispositivos portáteis e análise digital, permitindo que a informação molecular seja obtida cada vez mais próxima do local onde a doença está ocorrendo. Essa possibilidade poderá fortalecer programas de monitoramento, detecção precoce e tomada de decisão fitossanitária, desde que os ensaios sejam rigorosamente validados antes de sua utilização rotineira (YANG et al., 2025; NÉMETH; KOVÁCS, 2025). (APS Journals)

Referências

DUAN, Y. B. et al. Development and evaluation of a novel and rapid detection assay for Botrytis cinerea based on loop-mediated isothermal amplification. PLoS ONE, v. 9, n. 10, e111094, 2014. DOI: 10.1371/journal.pone.0111094. (PLOS)

GHOSH, R. et al. Development of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for rapid detection of Fusarium oxysporum f. sp. ciceris – wilt pathogen of chickpea. BMC Research Notes, v. 8, art. 40, 2015. DOI: 10.1186/s13104-015-0997-z. (PubMed Central (PMC))

KHAN, M. et al. Evaluation of different PCR-based assays and LAMP method for rapid detection of Phytophthora infestans by targeting the Ypt1 gene. Frontiers in Microbiology, v. 8, art. 1920, 2017. DOI: 10.3389/fmicb.2017.01920. (Frontiers)

NÉMETH, M. Z.; KOVÁCS, G. M. A comprehensive guide to loop-mediated isothermal amplification, an emerging diagnostic tool for plant pathogenic fungi. Frontiers in Plant Science, v. 16, 1568657, 2025. DOI: 10.3389/fpls.2025.1568657. (Frontiers)

NOTOMI, T. et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research, v. 28, n. 12, e63, 2000. DOI: 10.1093/nar/28.12.e63. (PubMed Central (PMC))

SCHOCH, C. L. et al. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 109, n. 16, p. 6241–6246, 2012. (PubMed Central (PMC))

SI AMMOUR, M. et al. Development of real-time isothermal amplification assays for on-site detection of Phytophthora infestans in potato leaves. Plant Disease, v. 101, n. 7, p. 1269–1277, 2017. DOI: 10.1094/PDIS-12-16-1780-RE. (PubMed)

YANG, L. et al. Application of loop-mediated isothermal amplification in plant pathogen detection. Phytopathology, v. 115, n. 1, 2025. DOI: 10.1094/PHYTO-10-23-0391-KC. (APS Journals)

Referências complementares

NILSSON, R. H. et al. The UNITE database for molecular identification of fungi: handling dark taxa and parallel taxonomic classifications. Nucleic Acids Research, v. 47, n. D1, p. D259–D264, 2019. (PubMed Central (PMC))

NÉMETH e KOVÁCS (2025) é, atualmente, uma das referências mais úteis para uma aula ou capítulo sobre LAMP especificamente aplicada a fungos fitopatogênicos, porque reúne os princípios da técnica, desenho de primers, métodos de visualização, aplicações, limitações e uma compilação dos ensaios publicados para fungos e oomicetos. (PubMed Central (PMC))

Taxonomia dos fungos cercosporoides: evolução dos conceitos de Cercospora e diversidade atual de gêneros

Introdução

Os fungos cercosporoides constituem um conjunto diversificado de fungos filamentosos, predominantemente associados à família Mycosphaerellaceae, dentro de Dothideomycetes, Ascomycota. Muitos desses fungos estão associados a manchas foliares e outras doenças de plantas cultivadas, ornamentais e florestais. Entretanto, a expressão “fungos cercosporoides” não corresponde a uma categoria taxonômica formal equivalente a gênero ou família; trata-se principalmente de uma designação baseada em características morfológicas compartilhadas por diferentes linhagens. A compreensão atual desse grupo resulta de sucessivas revisões morfológicas e, principalmente, de estudos filogenéticos multilocus (VIDEIRA et al., 2017; GROENEWALD et al., 2024). (PubMed)

A taxonomia dos cercosporoides passou por profundas modificações nas últimas décadas porque os caracteres morfológicos tradicionalmente utilizados para separar os gêneros apresentaram, em diversos casos, baixa correspondência com as relações filogenéticas. Características como coloração e forma dos conídios, organização dos conidióforos, presença de cicatrizes conidiogênicas e características dos hilos podem ser úteis para a identificação, mas algumas delas evoluíram independentemente em linhagens distintas. Dessa maneira, organismos morfologicamente semelhantes podem pertencer a gêneros filogeneticamente distantes (BAKHSHI et al., 2015; VIDEIRA et al., 2017). (Phytotaxa)

De Cercospora sensu lato à classificação filogenética

Um dos principais motivos para a atual complexidade nomenclatural é a circunscrição historicamente ampla de Cercospora. Na monografia de Chupp, publicada em 1954, numerosas espécies de fungos cercosporoides foram acomodadas em Cercospora em sentido amplo. Posteriormente, estudos morfológicos demonstraram que vários conjuntos de espécies poderiam ser distinguidos com base em características dos conídios, conidióforos e estruturas conidiogênicas, levando ao reconhecimento de diversos gêneros (GROENEWALD et al., 2024). (PubMed Central (PMC))

A utilização de dados moleculares modificou substancialmente essa interpretação. Estudos baseados em sequências de diferentes regiões do DNA demonstraram que alguns gêneros tradicionalmente delimitados por caracteres morfológicos não eram monofiléticos. Em outras palavras, espécies reunidas em determinado gênero pela aparência poderiam estar distribuídas em diferentes linhagens evolutivas. Essa constatação levou à revisão de conceitos genéricos e à criação, ressurgimento ou redefinição de diversos gêneros cercosporoides (VIDEIRA et al., 2017). (PubMed)

Um estudo particularmente importante foi realizado por Videira et al. (2017), que analisaram 415 isolados representando 297 táxons por meio de uma filogenia multilocus baseada principalmente em LSU, ITS e rpb2. O trabalho teve como um dos objetivos principais esclarecer as relações filogenéticas entre os gêneros de Mycosphaerellaceae e posicionar adequadamente os fungos cercosporoides dentro dessa diversidade. Os resultados demonstraram que a classificação baseada exclusivamente na morfologia não refletia adequadamente as relações evolutivas de vários grupos (VIDEIRA et al., 2017). (PubMed)

Por que a morfologia isoladamente não é suficiente?

A morfologia continua sendo indispensável para a taxonomia dos fungos cercosporoides, mas seu uso deve ser integrado aos dados moleculares. Bakhshi et al. (2015), por exemplo, demonstraram que um fungo morfologicamente semelhante a Cercospora coletado em Ammi majus agrupava filogeneticamente fora de Cercospora sensu stricto. A análise utilizou diferentes marcadores, incluindo LSU, ITS, ACT, TEF1-α e HIS, e levou à introdução do gênero Neocercospora. O estudo forneceu evidência direta de que características morfológicas consideradas típicas de Cercospora poderiam ter evoluído independentemente dentro de Mycosphaerellaceae (BAKHSHI et al., 2015). (Phytotaxa)

Esse fenômeno é particularmente importante porque demonstra a existência de homoplasia morfológica. Características semelhantes não necessariamente indicam ancestralidade comum recente. Assim, a observação microscópica de conidióforos e conídios pode indicar que determinado isolado pertence ao grupo dos cercosporoides, mas não necessariamente permite determinar com segurança o gênero ou a espécie (BAKHSHI et al., 2015; VIDEIRA et al., 2017). (Phytotaxa)

Cercospora atualmente

Cercospora permanece como um gênero taxonomicamente válido e fitopatologicamente importante, mas sua circunscrição atual é mais restrita que aquela utilizada em parte da literatura histórica. Consequentemente, o nome Cercospora encontrado em uma publicação antiga não deve ser automaticamente interpretado como equivalente ao conceito filogenético atual do gênero. A identificação histórica precisa ser analisada considerando a publicação original, a nomenclatura subsequente e os estudos filogenéticos disponíveis (VIDEIRA et al., 2017; GROENEWALD et al., 2024). (PubMed)

Essa questão é particularmente relevante em complexos de espécies de Cercospora, nos quais a morfologia pode apresentar grande sobreposição. Estudos contemporâneos utilizam combinações de marcadores moleculares e caracteres morfológicos para delimitar espécies, em vez de depender exclusivamente da aparência dos conídios ou dos conidióforos. Portanto, a determinação de Cercospora até espécie deve ser interpretada de acordo com a qualidade dos dados disponíveis para aquele complexo específico (BAKHSHI et al., 2015; VIDEIRA et al., 2017). (Phytotaxa)

Pseudocercospora: um gênero de grande diversidade

Pseudocercospora representa atualmente um dos principais gêneros de fungos cercosporoides associados a doenças de plantas. O gênero pertence à Mycosphaerellaceae e inclui espécies associadas a numerosos hospedeiros. Embora seus representantes apresentem morfologia cercosporoide, Pseudocercospora é tratado como um gênero distinto de Cercospora com base em evidências morfológicas e moleculares (GROENEWALD et al., 2024). (PubMed Central (PMC))

A revisão de Groenewald et al. (2024) representa uma das avaliações recentes mais abrangentes de Pseudocercospora. O estudo empregou filogenia multigênica e dados morfológicos, examinando materiais associados a 413 espécies de hospedeiros, pertencentes a 297 gêneros e provenientes de 60 países. Foram descritas 29 espécies novas, além da designação de epítipos e lectótipo para nomes previamente estabelecidos (GROENEWALD et al., 2024). (PubMed Central (PMC))

O estudo também evidencia uma questão importante para a taxonomia aplicada: mesmo depois de extensas análises filogenéticas, permanecem linhagens para as quais não existem evidências suficientes para estabelecer uma identificação específica definitiva. Portanto, a existência de uma sequência molecular semelhante a uma espécie conhecida não deve ser interpretada automaticamente como prova de identidade específica, principalmente quando não existem sequências confiáveis de material-tipo ou de culturas autenticadas para comparação (GROENEWALD et al., 2024). (PubMed Central (PMC))

Passalora e a necessidade de redefinição de gêneros

Passalora constitui outro exemplo importante da transformação da taxonomia dos cercosporoides. O conceito tradicional de Passalora foi utilizado para acomodar numerosos fungos morfologicamente semelhantes, mas estudos moleculares demonstraram que o conceito amplo do gênero não correspondia a uma única linhagem evolutiva. A revisão de Mycosphaerellaceae conduzida por Videira et al. (2017) contribuiu para restringir e reorganizar vários grupos anteriormente associados a Passalora sensu lato (VIDEIRA et al., 2017). (PubMed)

A instabilidade histórica de Passalora não significa que o gênero tenha deixado de existir. O que mudou foi sua circunscrição taxonômica. Algumas espécies anteriormente classificadas em Passalora foram transferidas para outros gêneros quando análises filogenéticas demonstraram que suas relações evolutivas não eram compatíveis com a permanência naquele gênero (VIDEIRA et al., 2017). (PubMed)

Um exemplo recente é fornecido por Kreth et al. (2025), que reavaliaram Cercospora malkoffii, espécie anteriormente tratada como Passalora malkoffii. Utilizando ITS, LSU, calmodulina, tef1, tub2 e rpb2, os autores demonstraram que a espécie pertence filogeneticamente a Fusoidiella. Como consequência, foi proposta a nova combinação Fusoidiella malkoffii, acompanhada da designação de um epítipo e de testes de patogenicidade (KRETH et al., 2025). (PubMed Central (PMC))

Esse exemplo demonstra que mudanças taxonômicas não ocorrem apenas pela descoberta de espécies novas. Uma espécie já conhecida pode mudar de gênero quando novos dados filogenéticos demonstram que sua posição taxonômica anterior não representa adequadamente sua história evolutiva (KRETH et al., 2025; VIDEIRA et al., 2017). (PubMed Central (PMC))

Outros gêneros cercosporoides

A reorganização de Mycosphaerellaceae resultou no reconhecimento de diversos gêneros cercosporoides, incluindo Cercospora, Pseudocercospora, Passalora, Zasmidium, Ramularia e outros grupos que foram segregados ou redefinidos a partir de conceitos taxonômicos anteriores. A classificação desses organismos deve ser entendida como resultado de hipóteses filogenéticas sustentadas por diferentes conjuntos de caracteres, e não como uma simples divisão morfológica baseada no aspecto dos conídios (VIDEIRA et al., 2017). (PubMed)

A situação de Ramularia também ilustra a mudança provocada pela integração entre nomenclatura e filogenia. A eliminação progressiva da nomenclatura dual entre formas sexuadas e assexuadas levou à reorganização de nomes historicamente associados a Mycosphaerella, enquanto os estudos filogenéticos permitiram reconhecer relações entre diferentes morfos anteriormente tratados como entidades nomenclaturais independentes (GROENEWALD et al., 2024). (PubMed Central (PMC))

Quais marcadores moleculares são utilizados?

A identificação molecular dos cercosporoides não depende de um único marcador universalmente suficiente para todos os grupos. O ITS é amplamente empregado em estudos de fungos, inclusive como marcador inicial, mas sua resolução pode ser insuficiente para separar espécies estreitamente relacionadas. Por essa razão, estudos taxonômicos de Mycosphaerellaceae frequentemente utilizam combinações de ITS com genes como actA, tef1, rpb2, tub2, cmdA, his3 ou outros marcadores, conforme o grupo analisado (VIDEIRA et al., 2017; GROENEWALD et al., 2024). (PubMed)

A escolha dos marcadores deve, portanto, ser orientada pela questão taxonômica. Um marcador adequado para uma triagem inicial pode não apresentar resolução suficiente para uma identificação em nível de espécie. A comparação deve ser feita preferencialmente com sequências provenientes de isolados autenticados, ex-tipos, epítipos ou outros materiais taxonomicamente bem caracterizados, evitando que uma identificação seja baseada simplesmente no maior percentual de identidade encontrado em um banco de sequências (GROENEWALD et al., 2024). (PubMed Central (PMC))

O que isso significa para o diagnóstico fitopatológico?

Para o diagnóstico de doenças de plantas, a principal consequência dessas mudanças é que a identificação de um fungo com morfologia cercosporoide não deve ser automaticamente registrada como Cercospora sp.. A observação microscópica pode estabelecer uma hipótese diagnóstica, mas a determinação do gênero e, principalmente, da espécie deve considerar a combinação de morfologia, hospedeiro, características culturais quando disponíveis e dados moleculares e filogenéticos (BAKHSHI et al., 2015; VIDEIRA et al., 2017). (Phytotaxa)

Para um laboratório de Fitopatologia, uma estratégia taxonomicamente mais segura é trabalhar em níveis progressivos de identificação. O diagnóstico pode inicialmente registrar “fungo cercosporoide associado à mancha foliar”, avançando posteriormente para gênero e espécie quando existirem evidências morfológicas e moleculares suficientes. Essa abordagem evita atribuições específicas sem suporte e é especialmente importante em grupos nos quais existem complexos de espécies e elevada similaridade morfológica (GROENEWALD et al., 2024). (PubMed Central (PMC))

Por que a taxonomia continua mudando?

A taxonomia dos cercosporoides permanece dinâmica porque novos isolados, novas sequências, novos materiais-tipo e novas análises filogenéticas continuam sendo incorporados. A revisão de Pseudocercospora publicada por Groenewald et al. (2024), por exemplo, acrescentou dezenas de espécies novas e demonstrou que ainda existem linhagens cuja posição específica não pode ser estabelecida com segurança. Isso indica que o conhecimento atual representa uma classificação em constante refinamento, e não um sistema completamente encerrado (GROENEWALD et al., 2024). (PubMed Central (PMC))

Assim, a principal mudança conceitual na taxonomia dos fungos cercosporoides foi a transição de uma classificação predominantemente baseada na morfologia para uma taxonomia integrativa, apoiada por morfologia, nomenclatura, dados moleculares e filogenia. O resultado foi a fragmentação de antigos conceitos amplos de Cercospora e Passalora e o reconhecimento de numerosos gêneros filogeneticamente mais coerentes (VIDEIRA et al., 2017; GROENEWALD et al., 2024). (PubMed)

Principais gêneros envolvidos

Gênero	Situação geral na taxonomia moderna	Principal questão taxonômica
Cercospora	Gênero válido	Circunscrição atual mais restrita que os conceitos históricos
Pseudocercospora	Gênero amplamente reconhecido	Elevada diversidade e numerosos complexos de espécies
Passalora	Gênero reconhecido em circunscrição restrita	O conceito Passalora s. lat. era filogeneticamente problemático
Nothopassalora	Gênero reconhecido	Resultante de reorganizações de espécies historicamente associadas a outros gêneros
Zasmidium	Gênero reconhecido	Circunscrições históricas foram revistas com dados moleculares
Ramularia	Gênero importante em Mycosphaerellaceae	Reorganização associada ao fim da nomenclatura dual
Neocercospora	Gênero estabelecido com base em filogenia	Demonstra que morfologia cercospora-like pode surgir em linhagens distintas
Fusoidiella	Gênero filogeneticamente reconhecido	Inclui espécies anteriormente tratadas em Passalora
Cercosporidium, Fulvia, Mycovellosiella e outros	Gêneros envolvidos na reorganização histórica	Representam linhagens que não devem ser agrupadas automaticamente em Cercospora

A tabela sintetiza os principais exemplos discutidos na literatura filogenética e não pretende representar todos os gêneros cercosporoides atualmente reconhecidos (VIDEIRA et al., 2017; GROENEWALD et al., 2024; KRETH et al., 2025). (PubMed)

Referências

BAKHSHI, M.; ARZANLOU, M.; BABAI-AHARI, A.; GROENEWALD, J. Z.; CROUS, P. W. Is morphology in Cercospora a reliable reflection of generic affinity? Phytotaxa, Auckland, v. 213, n. 1, p. 22–34, 2015. DOI: 10.11646/phytotaxa.213.1.2. (Phytotaxa)

GROENEWALD, J. Z.; CHEN, Y. Y.; ZHANG, Y.; ROUX, J.; SHIN, H.-D.; SHIVAS, R. G.; SUMMERELL, B. A.; BRAUN, U.; ALFENAS, A. C.; UJAT, A. H.; NAKASHIMA, C.; CROUS, P. W. Species diversity in Pseudocercospora. Fungal Systematics and Evolution, v. 13, p. 29–89, 2024. DOI: 10.3114/fuse.2024.13.03. (PubMed Central (PMC))

KRETH, L.-S.; GROENEWALD, J. Z.; BRAUN, U.; GÖTZ, M. Phylogeny and taxonomy of Cercospora malkoffii (Mycosphaerellaceae). Fungal Systematics and Evolution, v. 16, p. 233–242, 2025. DOI: 10.3114/fuse.2025.16.13. (PubMed Central (PMC))

VIDEIRA, S. I. R.; GROENEWALD, J. Z.; NAKASHIMA, C.; BRAUN, U.; BARRETO, R. W.; DE WIT, P. J. G. M.; CROUS, P. W. Mycosphaerellaceae – chaos or clarity? Studies in Mycology, v. 87, p. 257–421, 2017. DOI: 10.1016/j.simyco.2017.09.003. (PubMed)

Multilocus na taxonomia de fungos fitopatogênicos: fundamentos, aplicações e exemplos

A identificação taxonômica de fungos fitopatogênicos passou por uma transformação importante com a incorporação de dados moleculares. Durante muito tempo, a identificação dependia principalmente de caracteres morfológicos, como estruturas reprodutivas, dimensões e forma de conídios, conidióforos, ascomas, ascósporos e características culturais. Entretanto, a convergência morfológica, a plasticidade fenotípica e a existência de complexos de espécies cripticas mostraram que a morfologia isoladamente pode não refletir adequadamente as relações evolutivas entre os fungos. A utilização de múltiplos loci passou, assim, a constituir uma das principais ferramentas para delimitação de espécies e reconstrução filogenética em diversos grupos de fungos fitopatogênicos (VIDEIRA et al., 2017; ZHANG et al., 2021). (ScienceDirect)

O que significa uma análise multilocus?

A análise multilocus consiste na utilização conjunta de sequências de dois ou mais loci independentes para inferir as relações filogenéticas entre isolados. Em vez de depender da informação evolutiva contida em apenas uma região do genoma, a análise combina diferentes marcadores, aumentando a quantidade de caracteres informativos disponíveis para a reconstrução da história evolutiva dos organismos. Os loci podem ser concatenados em uma única matriz ou analisados separadamente e posteriormente comparados, dependendo da finalidade e do desenho do estudo filogenético (VIDEIRA et al., 2017; UDAYANGA et al., 2014). (ScienceDirect)

É importante distinguir MLST (Multi-Locus Sequence Typing) de uma análise filogenética multilocus em sentido amplo. No MLST, sequências de loci selecionados são utilizadas para caracterizar e comparar isolados, enquanto estudos taxonômicos multilocus normalmente procuram reconstruir relações filogenéticas e estabelecer limites entre espécies. Na prática da taxonomia de fungos, os termos podem aparecer associados, mas a finalidade do estudo deve ser considerada: identificação, delimitação de espécies, reconstrução filogenética ou caracterização da diversidade genética (UDAYANGA et al., 2014; SKANDALIS et al., 2017). (PubMed Central (PMC))

Por que o ITS não é suficiente para todos os fungos?

O espaçador interno transcrito, ou ITS, constitui um dos principais marcadores utilizados na identificação molecular de fungos e é extremamente útil para posicionar um isolado em determinado gênero ou complexo de espécies. Entretanto, sua capacidade de discriminação varia consideravelmente entre grupos taxonômicos. Em espécies muito próximas, diferentes linhagens podem apresentar sequências ITS idênticas ou muito semelhantes, impossibilitando uma identificação específica robusta baseada exclusivamente nesse marcador (VIDEIRA et al., 2017; UDAYANGA et al., 2017). (ScienceDirect)

Esse problema é particularmente evidente em gêneros que apresentam grande número de espécies filogeneticamente próximas. Nesses casos, um isolado pode apresentar 99% ou mais de identidade com várias espécies diferentes no GenBank, sem que isso signifique que pertença necessariamente à espécie com maior percentual de identidade. Por essa razão, a identidade molecular deve ser avaliada considerando múltiplos loci, a qualidade das sequências de referência e, preferencialmente, a posição do isolado em uma filogenia que inclua cepas-tipo, ex-tipo ou epítipo quando disponíveis (GROENEWALD et al., 2024; UDAYANGA et al., 2014). (PubMed)

Portanto, BLAST e filogenia multilocus não são procedimentos equivalentes. O BLAST permite encontrar sequências semelhantes em um banco de dados, enquanto a filogenia multilocus permite avaliar a posição evolutiva de um isolado em relação a um conjunto de táxons de referência. Em taxonomia, essa diferença é fundamental: a maior similaridade encontrada em uma busca não constitui, isoladamente, uma demonstração de identidade específica (GROENEWALD et al., 2024; ZHANG et al., 2021). (PubMed Central (PMC))

Quais genes são utilizados?

Não existe um conjunto universal de marcadores que seja igualmente eficiente para todos os fungos fitopatogênicos. A escolha depende do grupo taxonômico e do nível de resolução desejado. Entre os marcadores frequentemente utilizados encontram-se ITS, LSU, SSU, TEF1-α, TUB2, ACT, GAPDH, RPB2, CAL, HIS3 e CHS-1, além de marcadores específicos desenvolvidos para determinados gêneros ou complexos de espécies (VIDEIRA et al., 2017; ZHANG et al., 2021). (ScienceDirect)

O TEF1-α, que codifica o fator de elongação da tradução 1-alfa, é particularmente utilizado em vários grupos de Ascomycota devido à sua capacidade de fornecer resolução em nível de espécie. O gene TUB2, que codifica a β-tubulina, também apresenta elevada utilidade em diversos gêneros. Entretanto, a informatividade de cada marcador é dependente do grupo estudado; um gene altamente discriminativo em determinado gênero pode apresentar pouca variação em outro (UDAYANGA et al., 2014; ZHANG et al., 2021). (PubMed Central (PMC))

Exemplo 1 — Colletotrichum: talvez o melhor exemplo didático

O gênero Colletotrichum representa um dos exemplos mais claros da importância da abordagem multilocus na taxonomia de fungos fitopatogênicos. Durante décadas, numerosas doenças de antracnose foram atribuídas a espécies como C. gloeosporioides e C. acutatum em conceitos amplos. Estudos multilocus demonstraram posteriormente que esses nomes abrangiam conjuntos de espécies geneticamente distintas, atualmente tratados como complexos de espécies (DAMM et al., 2012; WEIR; JOHNSTON; DAMM, 2012). (PubMed Central (PMC))

No complexo Colletotrichum acutatum, por exemplo, análises utilizando ITS, GAPDH, CHS-1, HIS3, ACT e TUB2 permitiram separar numerosas linhagens que anteriormente eram agrupadas como C. acutatum em sentido amplo. A análise multilocus revelou uma diversidade de espécies muito maior do que aquela indicada pela morfologia e pelo ITS isoladamente (DAMM et al., 2012). (PubMed Central (PMC))

Um exemplo particularmente relevante para o Brasil foi o estudo de Bragança et al. (2016), que analisou isolados de Colletotrichum associados a antracnose de frutos. Utilizando ITS, HIS3, GAPDH, CHS-1, TUB2 e ACT, os autores demonstraram que os isolados pertenciam a diferentes espécies do complexo C. acutatum, incluindo C. nymphaeae, C. melonis, C. abscissum e uma espécie nova, C. paranaense. O resultado demonstra como uma identificação histórica baseada em C. acutatum poderia ocultar diversidade específica relevante para a Fitopatologia (BRAGANÇA et al., 2016). (ScienceDirect)

O mesmo fenômeno ocorre no complexo C. gloeosporioides. Nesse grupo, diferentes estudos demonstraram que a combinação de marcadores convencionais nem sempre apresenta resolução suficiente para todas as espécies. Por isso, marcadores adicionais, como ApMat e GS, podem ser empregados para aumentar a capacidade de discriminação entre espécies próximas (LIU et al., 2015). (PubMed Central (PMC))

A revisão abrangente de Colletotrichum realizada por Bhunjun et al. (2021) ilustra a dimensão desse problema. Os autores utilizaram uma filogenia de seis loci — act, chs-1, gapdh, his3, ITS e tub2 — para construir uma filogenia abrangente do gênero. A análise reuniu 250 espécies aceitas naquele momento e demonstrou que a combinação de loci produzia uma resolução consideravelmente maior que aquela obtida com ITS isoladamente (BHUNJUN et al., 2021). (PubMed Central (PMC))

Exemplo aplicado à soja

Essa abordagem é especialmente importante para a identificação de Colletotrichum associado à soja. Espécies como C. truncatum e C. plurivorum podem estar associadas a sintomas semelhantes, incluindo antracnose, podridões e problemas em diferentes órgãos da planta. A delimitação específica exige, portanto, a combinação de características morfológicas e marcadores moleculares adequados ao complexo taxonômico em questão (DAMM et al., 2019; BHUNJUN et al., 2021). (PubMed Central (PMC))

Exemplo 2 — Diaporthe: ITS pode levar a uma resolução insuficiente

Diaporthe é outro gênero extremamente importante para a Fitopatologia, pois inclui espécies patogênicas, endofíticas e sapróbias. Historicamente, muitos desses fungos foram identificados pelo estado anamórfico Phomopsis, o que gerou considerável confusão nomenclatural. Udayanga et al. (2014) analisaram 243 isolados utilizando ITS, TEF1, TUB2, HIS3 e CAL e obtiveram 95 clados, descrevendo 15 espécies novas e propondo novas combinações taxonômicas (UDAYANGA et al., 2014). (PubMed Central (PMC))

A importância dos diferentes loci para Diaporthe foi posteriormente avaliada de forma sistemática por Gomes et al. (2017). Os autores compararam cinco marcadores — ITS, TEF1, TUB2, CAL e HIS — em 142 isolados representando 96 espécies. A análise demonstrou que a separação das espécies era melhor quando os cinco loci eram utilizados conjuntamente e que uma filogenia baseada em TEF1, TUB2, CAL e HIS apresentava desempenho semelhante à análise com cinco loci, enquanto a retirada do ITS produzia pouca alteração na topologia principal (GOMES et al., 2017). (PubMed Central (PMC))

Esse resultado tem uma implicação prática importante: não se deve assumir que ITS seja sempre o melhor marcador para identificação de fungos fitopatogênicos. No gênero Diaporthe, por exemplo, TEF1 pode apresentar maior capacidade discriminativa que ITS, e combinações de TEF1, TUB2, CAL e HIS podem ser mais apropriadas para delimitação específica (GOMES et al., 2017). (PubMed Central (PMC))

Exemplo 3 — Botryosphaeriaceae: vários gêneros com morfologia semelhante

Os fungos da ordem Botryosphaeriales constituem outro grupo no qual a filogenia multilocus teve grande impacto. São encontrados como patógenos, endófitos e sapróbios, frequentemente associados a cancros, morte de ramos, podridões e manchas em plantas lenhosas. A identificação baseada exclusivamente em morfologia mostrou-se insuficiente para resolver adequadamente as relações entre vários gêneros e espécies (ZHANG et al., 2021). (PubMed Central (PMC))

Zhang et al. (2021) analisaram 230 isolados utilizando ITS, TEF1, TUB2, LSU e RPB2, combinando os dados moleculares com características morfológicas. O estudo reduziu 58 espécies a sinonímia e descreveu oito espécies novas, demonstrando que a aplicação de uma abordagem multilocus pode alterar significativamente a interpretação da diversidade existente em coleções de fungos (ZHANG et al., 2021). (PubMed Central (PMC))

Os autores observaram ainda que TEF1, TUB2 e RPB2 foram particularmente confiáveis para a reconstrução das relações, enquanto a combinação de ITS + TEF1 + TUB2 + RPB2 forneceu resolução consistente para a identificação em nível específico. Esse resultado mostra novamente que a eficiência de um marcador é dependente do grupo taxonômico estudado (ZHANG et al., 2021). (PubMed Central (PMC))

Exemplo 4 — Cercospora e fungos cercosporoides

A família Mycosphaerellaceae constitui outro excelente exemplo da necessidade de filogenia multilocus. Muitos fungos cercosporoides apresentam morfologia semelhante, e gêneros historicamente definidos com base em caracteres morfológicos demonstraram não representar necessariamente grupos monofiléticos. Videira et al. (2017) utilizaram LSU, ITS e RPB2 em uma análise envolvendo 415 isolados e 297 táxons para avaliar as relações entre os gêneros da família e esclarecer a posição dos cercosporoides (VIDEIRA et al., 2017). (ScienceDirect)

Esse trabalho demonstrou que a semelhança entre conidióforos e conídios não necessariamente corresponde à proximidade filogenética. Consequentemente, vários conceitos genéricos foram modificados, e espécies anteriormente agrupadas em gêneros amplos foram redistribuídas em diferentes linhagens. Esse processo explica parte importante da atual diversidade de gêneros cercosporoides reconhecidos na literatura (VIDEIRA et al., 2017). (ScienceDirect)

Em trabalhos mais recentes, estudos específicos de Pseudocercospora passaram a utilizar combinações como ITS, ACT, TEF1 e RPB2, associadas a dados morfológicos e, quando possível, materiais-tipo ou epítipos. A revisão de Groenewald et al. (2024) demonstrou que ainda existem linhagens filogenéticas cuja posição específica permanece sem nome formal, evidenciando que mesmo análises multilocus extensas não eliminam completamente a incerteza taxonômica (GROENEWALD et al., 2024). (ScienceDirect)

Exemplo 5 — Alternaria, Bipolaris e outros fungos

A necessidade de escolher diferentes marcadores também é observada em outros gêneros fitopatogênicos. Para Alternaria, por exemplo, ITS pode apresentar resolução limitada para determinados complexos, sendo utilizados marcadores adicionais como GAPDH, RPB2 e TEF1. Em Bipolaris, combinações envolvendo ITS, GAPDH e TEF1 podem ser utilizadas para melhorar a resolução específica. Isso demonstra que não existe uma “receita universal” de multilocus para todos os fungos fitopatogênicos (GARCÍA et al., 2024). (PubMed Central (PMC))

Assim, o laboratório que pretende estabelecer uma rotina molecular de identificação deve primeiro determinar qual é o gênero ou complexo de espécies provável e, a partir disso, selecionar os marcadores reconhecidamente informativos para aquele grupo. Utilizar o mesmo conjunto de primers e genes para todos os fungos pode gerar resultados com resolução insuficiente ou interpretações taxonômicas inadequadas (GARCÍA et al., 2024). (PubMed Central (PMC))

Como funciona uma identificação multilocus na prática?

Em um estudo taxonômico, o processo geralmente começa com a obtenção do isolado e sua caracterização morfológica. O DNA é então extraído e diferentes regiões gênicas são amplificadas por PCR e sequenciadas. As sequências são submetidas a controle de qualidade, alinhadas com sequências de referência e utilizadas para reconstruir árvores filogenéticas por métodos como Maximum Likelihood (ML) e Bayesian Inference (BI), frequentemente utilizando modelos de substituição específicos para cada locus (DAMM et al., 2012; BHUNJUN et al., 2021). (PubMed Central (PMC))

Um ponto importante é que os loci não devem ser simplesmente concatenados sem avaliação prévia. Os estudos multilocus normalmente verificam se existem conflitos significativos entre as árvores produzidas individualmente. Quando os conjuntos de dados apresentam topologias suficientemente congruentes, os loci podem ser combinados em uma matriz concatenada, aumentando a quantidade de caracteres informativos disponíveis para a reconstrução filogenética (DAMM et al., 2012; UDAYANGA et al., 2014). (PubMed Central (PMC))

A interpretação da árvore também exige cuidado. Um agrupamento bem sustentado de um isolado com uma espécie de referência é uma evidência importante, mas a identificação taxonômica deve considerar a qualidade das sequências utilizadas, a representatividade das amostras, a posição das cepas-tipo e a existência de possíveis complexos de espécies. Uma árvore filogenética não corrige automaticamente uma base de dados de referência incorreta (GROENEWALD et al., 2024; ZHANG et al., 2021). (PubMed Central (PMC))

Multilocus não significa simplesmente “usar vários genes”

É importante destacar que aumentar o número de marcadores não garante automaticamente uma identificação melhor. O princípio fundamental é utilizar loci informativos para o grupo taxonômico estudado. Um conjunto de cinco genes pouco variáveis pode apresentar menor poder discriminativo que dois ou três genes altamente informativos. Estudos de Diaporthe demonstram claramente essa situação: a contribuição dos diferentes loci varia e alguns conjuntos reduzidos podem reproduzir grande parte da resolução obtida com cinco marcadores (GOMES et al., 2017). (PubMed Central (PMC))

Da mesma forma, em Colletotrichum, os marcadores mais informativos variam entre os complexos de espécies. No complexo C. gloeosporioides, por exemplo, ApMat e GS apresentam grande utilidade, enquanto outros complexos podem depender de combinações envolvendo GAPDH, HIS3, TUB2, ACT e CHS-1. Portanto, a escolha dos marcadores deve ser taxon-specific, e não baseada em um protocolo universal (BHUNJUN et al., 2021; BOUFLEUR et al., 2021). (PubMed Central (PMC))

Multilocus × identificação por BLAST

Uma situação muito comum em laboratórios é obter uma sequência ITS, realizar BLAST no GenBank e selecionar a espécie que apresenta a maior identidade. Embora essa estratégia seja útil para uma identificação preliminar, ela apresenta limitações importantes. Em grupos com espécies próximas, diversas espécies podem compartilhar valores de identidade muito elevados, e o resultado do BLAST depende da qualidade e da correta identificação das sequências depositadas no banco (GROENEWALD et al., 2024; ZHANG et al., 2021). (PubMed Central (PMC))

Por essa razão, para uma identificação taxonômica robusta, o ideal é combinar BLAST para triagem + seleção de referências taxonomicamente confiáveis + multilocus + filogenia + morfologia. Essa abordagem permite transformar uma identificação baseada em similaridade de sequência em uma hipótese filogenética testável (UDAYANGA et al., 2014; BHUNJUN et al., 2021). (PubMed Central (PMC))

O papel das cepas-tipo e dos epítipos

Um aspecto particularmente importante da taxonomia molecular é a utilização de sequências provenientes de materiais nomenclaturais confiáveis. Quando uma espécie possui uma sequência derivada de ex-tipo ou ex-epítipo, essa sequência fornece uma referência muito mais robusta para posicionar novos isolados do que uma sequência depositada em banco apenas com identificação baseada em literatura antiga (GROENEWALD et al., 2024; ZHANG et al., 2021). (PubMed Central (PMC))

Esse aspecto explica por que trabalhos taxonômicos modernos frequentemente realizam epitipificação. Quando o material original não permite obtenção de DNA ou não apresenta características suficientes para associar inequivocamente o nome a uma linhagem molecular, um epítipo pode ser designado para estabilizar a aplicação do nome e permitir sua conexão com dados moleculares modernos (DAMM et al., 2019; ZHANG et al., 2021). (PubMed Central (PMC))

O que o multilocus mudou na Fitopatologia?

A principal contribuição do multilocus foi revelar que muitos “patógenos” considerados uma única espécie durante décadas são, na realidade, conjuntos de espécies geneticamente distintas. Isso ocorreu de maneira particularmente evidente em Colletotrichum, Diaporthe, Botryosphaeriales e Mycosphaerellaceae. Como consequência, nomes tradicionalmente utilizados em diagnósticos passaram a ser revisados, espécies foram segregadas ou sinonimizadas e novos gêneros e espécies foram descritos (UDAYANGA et al., 2014; VIDEIRA et al., 2017; ZHANG et al., 2021). (PubMed Central (PMC))

Essa mudança tem consequências diretas para a Fitopatologia aplicada. A espécie de fungo presente em uma cultura pode influenciar estudos de distribuição geográfica, gama de hospedeiros, agressividade, resistência a fungicidas, epidemiologia, diagnóstico molecular e desenvolvimento de estratégias de manejo. Portanto, uma identificação taxonômica incorreta pode comprometer etapas subsequentes da pesquisa (BRAGANÇA et al., 2016; BOUFLEUR et al., 2021). (ScienceDirect)

Síntese para o diagnóstico de fungos fitopatogênicos

Etapa	Informação obtida	Limitação
Sintomas	Síndrome da doença	Não identifica espécie
Morfologia	Grupo/gênero provável	Pode ocorrer convergência
ITS	Triagem taxonômica	Pode não separar espécies próximas
Marcador adicional	Aumenta resolução	Informatividade depende do grupo
Multilocus	Relações filogenéticas mais robustas	Exige seleção adequada dos loci
ML/BI	Suporte às relações	Depende do conjunto de referência
Ex-tipo/epítipo	Referência nomenclatural	Nem todas as espécies possuem dados adequados
Patogenicidade	Associação causal	Não substitui a identificação taxonômica
Identificação integrada	Morfologia + multilocus + filogenia	É a abordagem mais robusta

A interpretação mais adequada, portanto, é que o multilocus não substitui a morfologia; ele integra diferentes linhas de evidência. Para fungos fitopatogênicos, a taxonomia moderna tende a combinar morfologia, dados moleculares, filogenia, informações nomenclaturais e, quando pertinente, dados ecológicos e de patogenicidade (VIDEIRA et al., 2017; GROENEWALD et al., 2024). (ScienceDirect)

Conclusão

O emprego de análises multilocus representa uma das principais mudanças metodológicas na taxonomia dos fungos fitopatogênicos. A utilização de diferentes regiões gênicas permite aumentar a resolução filogenética, reconhecer complexos de espécies, corrigir identificações históricas e estabelecer limites entre espécies que apresentam morfologia semelhante. Entretanto, a escolha dos marcadores deve ser específica para o grupo estudado, pois não existe um conjunto universal de genes capaz de resolver todos os grupos de fungos fitopatogênicos (GOMES et al., 2017; ZHANG et al., 2021). (PubMed Central (PMC))

Em termos práticos, a taxonomia molecular moderna deve ser compreendida como uma abordagem de evidências integradas. Para um isolado fitopatogênico, uma identificação robusta pode seguir a sequência: sintoma → isolamento → morfologia → ITS/triagem molecular → seleção de marcadores específicos → multilocus → filogenia → comparação com materiais de referência → identificação taxonômica. Quanto mais próximo o problema estiver do limite entre espécies, maior será a importância de utilizar múltiplos loci e referências taxonomicamente bem fundamentadas (UDAYANGA et al., 2014; GROENEWALD et al., 2024). (PubMed Central (PMC))

Referências

BHUNJUN, C. S. et al. Updating species diversity of Colletotrichum, with a phylogenomic overview. Fungal Diversity, v. 111, p. 1–40, 2021. (PubMed Central (PMC))

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