Práticas em Microbiologia: Isolamento e Repicagem de Fungos - Aluna Ana Carolina Damião Araújo - Prof. Milton Luiz da Paz Lima.

Titulo: Isolamento e repicagem de fungos.

Aluna: Ana Carolina Damião Araújo

Introdução:

     O vídeo tem como objetivo, apresentar de forma prática e facilitada, o modo de realizar isolamento e repicagem de fungos patogênicos e não patogênicos.

     O isolamento de fungos é obtido em cultura pura apartir de tecidos doentes do hospedeiro, quando obtido um organismo em cultura pura não significa que ele seja o agente causal da doença. Vários meios são utilizados porém o mais usado é o Batata-Dextrose-Ágar (BDA) e Extrato de Malte-Ágar (EMA). O organismo é cultivado em placas de Petri, repicado em tubos com meio BDA inclinado, para ser armazenado.

     Os métodos básico de isolamento são: direto e indireto. O isolamento direto é a transferência com auxilio de um estilete, de estruturas do patógenos (hifas, esporos, rizomorfos, escleródios) direto do órgão infectado, quando a pretensão é trabalhar com esporos e a amostra não apresenta pode-se estimular a esporulação mantendo a amostra em uma câmara úmida (de um a três dias) .

     O isolamemento indireto é a transferência para meio de cultura, de porções infectadasde tecido do hospedeiro.O isolamento indireto varia de acordo com o órgão ou tecido infectado. O patógeno está dentro dos tecidos da planta sem produzir frutificações na superficie do orgão lesionado. Para evitar a incidência de contaminantes ,o material recém-infectado, que o patógeno se encontraem crescimento ativo. O isolamento de fungos dos tecidos de órgão não-lenhosos, organismos saprófitas na superficie do órgão lesionado são elminado pela desifestaçãosuperficialde tecidos em solução desinfetante, o patógeno encontra-se no interior dos tecidos não é afetado pelo desinfetante a menos que o tempo seja longo.

     As repicagens são métodos de rotina mais usados para manutenção de culturas, que consiste na repicagem periódica do microorganismo em novos tubos de ensaio que contêm meio de cultura, os tubos são submetidos a temperatura que favoreça o crescimento do patógeno até que haja a colonização do meio de cultura. Para evitar contaminações deve-se usar tampões de algodão hidrófobo. As repicagens pode induzir o patógeno ao hábito saprofítico, à alteração de sua morfologia, à diminuição e à perda de sua capacidade de sua esporular e à diminuição de sua agressividade. Na repicagem devem-se transferir apenas porções jovens e esporulantes da colônia.

Materiais necessários:

     Para realizar o isolamento são necessarios os seguintes materiais: microscópio estereoscópio (lupa), estilete, lamparina com álcool,placas de petri com meio BDA e tubos de ensaio com BDA inclinado.

Para a repicagem são necessários: culturas de microorganismo em placa de petri, frascos esterilizados de 10 mL de capacidade e água destilada ou solução NaCl 0,85% esterilizadas.

Metodologia:

     O isolamento direto são usados os procedimentos de focalizar as estruturas do patógeno em lupa, flambar o estilete, resfriar a ponta do estilete tocando levemente no meio de cultura, transferir estruturas visualizadas para um placa com meio de cultura, incubar até o aparecimento da colônia desejada e repicar a colônia em tubos com BDA inclinado.

     O isolamento indiretosão usados os procedimentos de lavar o material infectado cuidadosamente com água e detergente, enxugar com papel, com o auxilio de uma lâmina flambada retirar fragmentosdas margens da lesãoe transferir para a solução aquosa de álcool 70%, transferir fragmentos de tecidos para a solução desinfestante mantendo-os imersos na solução,1 min. é o bastante para eliminar os contaminantes,com a pinça flambada remover fragmentos da solução desinfestante, plantar três ou quatropor placa contendo meio de cultura, manter as placas em encubadoras e repicar a colônia em tubos com BDA inclinado.

     A repicagem é efetuada através dos procedimentos: colocar 5mLde água destilada esterilizada ou solução de NaCl 0,85% em frascosde vidro de 10 mL de capacidade, com condições assépticas colocar em cada frasco cinco discos de cultura do fungo, vedar os frascos com algodãoe armazenar em sala refrigerada.

Conclusões:

     Conclui-se que o isolamento tem como vantagem permitir obter organismo puro, isento de contaminações de microorganismossaprófitas associados ao tecido infectado, permitir saber qual organismo está sendo transferido para o meio e permitirestabelecer comparações entre as estruturas do organismo formadas na superfície do hospedeiro e em cultura.

     O método da repicagem para trabalhos com fungos fitopatogênicos realizados num prazo de um semestre, o método pode ser utilizado com sucesso. Este método é usado para manutenção de culturas à curto prazo.

Referências Bibliográficas:

CASTELLANI, A. Viability of some pathogenic fungi in distilled water. J. Trop. Med. Hyg. 42:225, 1939.

DHINGRA, O.D. & SINCLAIR, J.B. Basic plant pathology methods. Boca Raton: CRC Press, 1995. 434 p.

ESFS Disponivel em:www.esfs.br/disciplinas/bio221/isolamento_de_fungos.rtf, acessado em dezembro de 2011.

FIGUEIREDO, M.B. Métodos de preservação de fungos fito patogênicos. Biológico 63:59-68,2001.

GONÇALVES, R.C.; ALFENA, A.C.; MAFIA, L.A. & CROUS, P.W. Evaluation of biossays to quatify Cylindrocladium inocula in soil. Mycoscience 41:216-4, 2001.

JOHANSON, A. Detections of sigatoka leaf spot pathogens of banana: by the polymerase chain reaction. [S.I.] : Natural Resources Institut, 1997. 37 p.

RIKER, A.J & RIKER, R.S. Introduction to research on plant diseases. St. Louis: John S. Swift Co.,1936.